流式细胞术（Flow Cytometry, FCM），是通过检测悬液中的单个细胞或其他生物粒子上所标记的荧光信号，来对单个细胞或生物粒子进行定量分析和分选的一种技术。为协助大家快速上手流式细胞术，本期将介绍流式细胞术的基本概念、实验流程以及结果分析三大部分。

基本概念

1. 流式细胞仪(Flow Cytometer)：是集现代物理电子技术、激光技术、计算机技术于一体的先进科学技术设备。

2. 流式细胞术(Flow Cytometry)：利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的单列细胞或生物颗粒进行逐个、多参数、快速的定性、定量分析或分选的技术。

图1. 什么是流式细胞术？

实验流程

第一步：设计流式细胞实验

（1）明确靶细胞基本特性，包括细胞大小、特异性标志物的表达丰度与定位。

（2）结合流式细胞仪配置，挑选适配的荧光偶联抗体。

（3）配色问题：低丰度标志物配强荧光染料，高丰度标志物配中 / 弱荧光染料；规避荧光溢漏通道与相关标志物的搭配。

（4）实验对照：流式对照至少有 5 种。主要目的是为了避免出现的假阳性或假阴性结果。下面我们以一个具体的凋亡实验来看看如何设置对照组：

图2. Annexin V/PI 检测凋亡的原理示意图

①生物学对照： Vehicle 组（DMSO 溶剂处理组），作为药物处理组的实验参照。

②空白对照： 不加任何染料的细胞样本，排除细胞自身荧光背景，确定各检测通道。

③同型对照： 评估抗体 Fc 段与靶细胞（尤其免疫细胞）Fc 受体的非特异性结合，避免干扰实验结果。

④补偿对照（单阳性对照）： 单个荧光通道染色的细胞样本，用于校正不同荧光之间的信号溢漏，保证多色检测的准确性。

⑤FMO对照（荧光减一对照）： 缺失某一目标荧光抗体的染色样本，用于设定该荧光通道的阳性阈值，有效区分弱阳性信号与背景噪音。

第二步：细胞悬液样本制备

对不同来源和不同形式的样品，根据各种样品的特点可选择不同的分散方法。

（1）单层培养细胞、血液、各种脱落细胞等样品

标本经过简单的制备悬液，离心分离处理，就可以得到分散较好的单个细胞悬液，是理想的流式细胞术检测对象。

（2）不同组织来源的实体组织标本

采用酶消化法、机械法和化学试剂处理法来分散细胞。

（3）石蜡包埋组织单细胞悬液

可使大量存档的临床资料重新得到研究与利用，从而扩大了流式细胞术的应用范围。样品制备一般通过切片、脱脂、水化、消化及终止消化后过滤再收集细胞悬液，去除碎片的单细胞悬液用 70％ 乙醇固定保存。

第三步：流式检测操作流程

流式细胞仪的使用一般分为三个步骤。第一，是仪器前阶段，包括试剂的准备，细胞制备、细胞的荧光染色；第二，是流式细胞仪阶段，主要是仪器的操作；第三，是结果分析阶段。

（一）细胞和试剂的准备

1. 细胞样品：来源淋巴细胞或外周血的白细胞；

2. 荧光标记单克隆抗体：常用的有FITC（fluorescein‑isothiocyanate）和PE（phycoerythrin）标记的单克隆抗体；

3. 封闭抗体：抗Fc受体抗体；

4. FACS缓冲液：1xPBS 950 ml； FCS 40 ml；10%叠氮钠溶液 10 ml；

5. 仪器缓冲液（FACS‑flow）：仪器厂家提供

6. FACS清洁液（FACS clean ）和FACS洗净液（FACS rinse）：仪器厂家提供

（二）操作步骤

1. 单细胞悬液的制备：将1×10⁵~1×10⁷的细胞放入1.5 ml离心管中3000 r/min 离心5分钟，弃上清；加入FACS缓冲液100 ul 悬浮细胞。

2. 封闭细胞表面Fc受体：在步骤1中加入Fc受体抗体0.5 ul（0.5 mg/ml），水浴3分钟。

3. 细胞与荧光抗体结合：在步骤2中加入荧光抗体1 ul（0.5 mg/ml），水浴30分钟。

4. 洗细胞去除游离的荧光抗体：在步骤3中加入FACS缓冲液350 ul，轻轻混匀，3000 r/min，离心5分钟，弃上清，重复步骤（4）2次。

5. 上样前处理：取100 ul 仪器缓冲液加入步骤（4）获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析。

（三）上机注意事项

① 设置仪器电压应该遵循两点：

  a）避免阴性信号过强，一般在坐标轴10³之前；

  b）阳性信号必须在仪器检测范围内，否则后续无法分析数据。

② 对于多色流式，需要利用单染管来测量补偿值。

③ 收集细胞的数量没有严格的要求，但是对于稀有的细胞群，收集的细胞量大才有助于分析。

流式检测结果分析

流式结果分析需通过 “圈门” 筛选目标细胞群，常见结果图有 3 类：

①直方图： 单通道数据，Y 轴为细胞数，X 轴为荧光信号值。

②散点图（密度图）： 双通道数据，每个点对应单个细胞。

③等高线图： 同双通道数据，以地理等高线形式呈现，环线代表相同细胞密度区域，中央为细胞聚集核心。

图3. 三种类型的流式结果图

流式图1‑细胞周期分析

细胞周期分析：可以用来检测细胞DNA的含量，从而判断细胞所处的周期阶段（G0/G1、S、G2/M期）；可以展示不同周期阶段细胞的分布和比例，有助于研究细胞增殖和分裂的调控机制。

图4. 流式图1‑细胞周期分析

（1）元素解读

图A、B（以图A为例）

①横坐标为DNA含量，括号里的词组缩写为PI‑A，PI是碘化丙啶（一种与DNA相结合的荧光染料）；A代表荧光信号的面积，即横坐标指代DNA含量

②纵坐标为检测到的细胞数量

③从左到右的3个峰分别对应G0G1、S、G2/M阶段

④图例：细胞在3个不同细胞周期所占的比例，例：在图A中，处于G0G1期的细胞占总体的52.10%

图C

①纵坐标为不同细胞周期分布的细胞百分比

②横坐标为3个细胞周期

③图例：实验组为采用低浓度JXS水提液31.25µg·mL^－1刺激细胞

（2）结果解读

流式细胞术检测结果发现，低浓度JXS水提液31.25 µg·mL^－1刺激ECA‑109细胞24 h后，G0/G1 期细胞数量大幅度减少（P＜0.01），S期细胞基本不变，G2/M期细胞显著增加（P＜0.01），证明JXS水提液将ECA‑109细胞周期阻滞在G2/M期。

2. 流式图‑细胞表型分析

细胞表型分析：通过检测细胞表面的特定抗原或受体，可以区分不同类型的细胞（如T细胞、B细胞等）；还能分析不同细胞亚群的分布和比例，有助于研究细胞的分化和功能。

图5. 流式图‑细胞表型分析

（1）元素解读

荧光标签：

  GFP（绿色荧光蛋白）、mCherry（红色荧光蛋白）

  FSC： 前向角散射光，能体现细胞的相对大小（不能具体到多少微米）

  SSC： 侧向角散射光，能体现细胞的颗粒度（细胞的复杂程度：细胞器的多少、细胞表面的凹凸程度等）

针对小鼠抗原的抗体： Ly6G‑APC、CD11b‑BV711、F4/80‑PE‑Cy7、SiglecF‑PE

（2）对照组结果（图a）

从未注射药物的小鼠模型中提取骨髓来源的细胞，通过流式细胞术检测确定是否为白血病细胞（a①），再进行白血病细胞的表型分析（a②~④）

图a①：未经Dox作用的白血病细胞能检测到GFP、mCherry荧光，且白血病细胞占样品总量的38%

图a②：FSC为中间值，表示检测到的细胞大小为中等水平；SSC值偏小，表示细胞颗粒度较小（细胞表面较光滑、细胞器偏少等）

图a③：检测到的荧光主要位于左下角（即CD11b‑，Ly6G‑），双阴性；左上角的“1”表示在该区域检测到的细胞量占总量的1%

图a④：检测到的荧光主要位于左下角（即F4/80‑，SiglecF‑）；左下角的“99”表示在该区域检测到的细胞量占总量的99%

图a⑤：检测到的未分化的白血病细胞电子显微镜图像

（3）实验组结果（图b）

给小鼠模型注射Dox，8天后从体内提取骨髓来源的细胞，通过流式细胞术检测确定是否为白血病细胞（b①），再进行白血病细胞的表型分析（b②~⑧）

图b①：经Dox作用的白血病细胞能检测到低GFP、高mCherry荧光，且白血病细胞占样品总量的55%

图b②：通过FSC、SSC指标可发现，经Dox诱导的白血病细胞分化成两种细胞类型，SSC^HIGH的细胞量占比18%，SSC^LOW的占比82%

图b②~⑤：SSC^HIGH组的细胞再经过4种抗体荧光指标检测，显示为（F4/80+、SiglecF+）双阳性，即为嗜酸性粒细胞

图b②&⑥~⑧：SSC^LOW组的细胞同理检测后，显示为（CD11b+，Ly6G+）双阳性，即为中性粒细胞

（4）结果解读

对照组与实验组进行比较，得出实验组在注射Dox后的8天左右，白血病细胞GFP的表达受到抑制，且Dox诱导的分化导致两种白血病衍生的成熟骨髓谱系亚群出现，即中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。

总结

随着生物技术与仪器制造革新，流式细胞术的应用场景与潜力将持续拓展。技术上，多色流式荧光通道会增多，搭配高灵敏度荧光染料，可同步分析更多细胞标志物，解析细胞亚群异质性；仪器自动化、智能化升级将简化流程、减少误差，提升稀有细胞检测效率。应用上，其将进一步渗透临床诊断、肿瘤免疫治疗等领域，结合单细胞测序等技术，实现细胞表型与基因表达深度关联，助力解析生命机制。