多肽是一种由两个或多个氨基酸通过肽键（酰胺键）连接而形成的化合物。多肽修饰种类繁多，从修饰位点不同则可分为 N端修饰 、 C端修饰 、 侧链修饰 、 氨基酸修饰 、 骨架修饰 等（图1）。作为一种改变肽链主链结构或侧链基团的重要手段，多肽修饰可有效改变肽类化合物的理化性质、增加水溶性、改变其生物分布状况、延长体内作用时间、降低毒副作用、消除免疫原性等。本期内容介绍几种最主要的多肽修饰及特点。

图1. 多肽修饰类型

环化修饰通过在肽链内形成共价键（如 二硫键、酰胺键、硫醚键 ），将线性多肽转化为环状结构，减少蛋白酶识别位点并固定优势构象。是多肽药物研发中最常用的修饰策略之一，尤其适用于含 半胱氨酸（Cys） 、 赖氨酸（Lys） 、 天冬氨酸（Asp） 等残基的多肽。环状多肽通常都是通过环化来实现的，根据环化方式可以分为侧链‑侧链式、终端‑侧链式、终端‑终端式（头尾相连式）。

图2. 多肽环化类型

糖基化通过在多肽的 Asn（N‑糖基化）或 Ser/Thr（O‑糖基化）残基上 连接单糖（如葡萄糖、半乳糖）或寡糖，模拟天然糖蛋白结构 ，改善多肽的水溶性、稳定性与免疫原性，尤其适用于抗体偶联药物（ADC）的 linker 修饰。

图3. 侧链糖基化修饰

操作流程（N‑糖基化）

▸ 固相合成时引入 Fmoc‑Asn (GlcNAc)‑OH（GlcNAc 为 N‑乙酰葡萄糖胺，核心单糖）；

▸ 继续延伸糖链（如用糖基转移酶催化添加半乳糖）；

▸ 切割纯化，得到糖基化多肽。

磷酸化多肽修饰是通过化学或酶促反应将磷酸基团添加到多肽的Ser、Thr或Tyr残基侧链羟基的过程，主要用于研究蛋白质功能及信号传导机制。根据磷酸化发生的氨基酸残基类型，主要分为四类：

①O‑磷酰化多肽： 由丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等含羟基的氨基酸残基磷酸化形成；

②N‑磷酰化多肽： 由精氨酸（Arg）、赖氨酸（Lys）等含氨基的氨基酸残基磷酸化形成；

③酰基磷酸肽： 由天冬氨酸（Asp）或谷氨酸（Glu）等含羧基的氨基酸残基磷酸化形成；

④S‑磷酰化多肽： 由半胱氨酸（Cys）等含巯基的氨基酸残基磷酸化形成。

图4. 多肽磷酸化

操作流程（磷酸化）

▸ 固相合成时使用 Fmoc‑Tyr (PO (OBzl)₂)‑OH，切割后用 TFA 脱除 Bzl 保护基，得到磷酸化 Tyr。

▸ 核心试剂：Fmoc‑Tyr(PO(OBzl)₂)‑OH、TFA。

甲基化（Methylation）通常被用来引入到多肽合成中以阻止氢键的形成，进而使得多肽更加耐受生物降解和清除，最初出现在天然多肽中。

修饰位点：赖氨酸 Lys、精氨酸 Arg 为主；赖氨酸可发生单、二、三甲基化，精氨酸分对称 / 不对称二甲基化

化学本质：甲基转移酶以 S‑腺苷甲硫氨酸 SAM 为甲基供体，可逆修饰氨基酸含氮侧链；修饰不改变电荷，仅微调空间位阻与疏水特性

生理功能：组蛋白甲基化是表观遗传标记，不同甲基化数目、位点决定基因转录激活或沉默；非组蛋白甲基化调控 p53 等抑癌蛋白活性、RNA 剪接、DNA 损伤修复、细胞命运分化。

多肽 N 端脂肪酸酰化能够介导多肽或蛋白质结合细胞膜。目前豆蔻酰化主要分为两类：

N 端甘氨酸豆蔻酰化（N‑Gly‑myristoylation） 这是最经典、研究最充分的豆蔻酰化形式。豆蔻酰基以酰胺键共价结合于蛋白质 N 端甘氨酸（Gly）的 α‑氨基。底物具有明确序列特征：蛋白 N 端第二位氨基酸为甘氨酸；翻译后，起始甲硫氨酸经甲硫氨酸氨基肽酶切除，暴露甘氨酸的游离氨基，进而发生修饰。

赖氨酸豆蔻酰化 属于近年新发现的可逆型豆蔻酰化，豆蔻酰基通过酰胺键结合在蛋白内部赖氨酸残基的 ε‑氨基上。该修饰的生理功能及其调控的信号通路尚处在初步研究阶段，是当下的研究热点。

生物素化是将 生物素基团或残基掺入生物分子（如多肽、蛋白质和其他大分子） 的过程，也被称为生物素标记，因为生物素（一种水溶性维生素）被用作目标生物分子的标签并将其用作探针。

生物素‑链霉亲和素相互作用由于其特异性和高亲和力（Kd<10^‑10 M）而被用作其他标记技术的基础，用于标记、检测和纯化多肽、蛋白质和其他生物分子。因此，多肽的生物素化是一种非常成功和有效的方法，用于将多肽结合到链霉亲和素包被的表面，并经常用于标记多肽。这种多肽修饰通常在多肽链末端进行，但也可以位于链的任何位置。

多肽通常含有氨基、羧基或巯基等活性基团，可以与各种带有活性酯或异硫氰酸酯结构的荧光染料（如FITC、NHS‑ester型Cy5等）通过共价键进行修饰，形成稳定的荧光多肽复合物。用的荧光标记方式包括：

▸ NHS酯法：利用Cy3/Cy5/Cy7‑NHS酯与多肽中的赖氨酸残基反应；

▸ 异硫氰酸酯法（FITC）：与多肽氨基反应形成脲键，很常见；

▸ 马来酰亚胺法：用于与巯基反应，适合半胱氨酸末端多肽修饰；

▸ 点击化学法：适用于有叠氮/炔基官能团的多肽与染料的特异性标记。

荧光染料波长范围从绿光到近红外，如 FITC（绿色）、Cy3（橙红）、Cy5（红光）、Cy7（近红外），适用于不同层级的生物样品观察和活体成像。

聚乙二醇（PEG）是一种无毒性、生物相容性好的高分子聚合物，通过共价键连接多肽后，可在多肽表面形成 “水化层”，减少肾脏清除与蛋白酶攻击，是提升多肽药代性能的 “金标准” 修饰。

①核心原理

PEG 的分子量（如 2kDa、5kDa、20kDa）与 修饰位点（Cys、Lys、N 端）决定修饰效果：小分子量 PEG（2kDa）提升溶解度，大分子量 PEG（20kDa）显著延长半衰期；Cys 位点修饰（定点修饰）纯度更高，Lys 修饰（随机修饰）操作更简单。

图5. 多肽磷酸化

②操作流程（Cys 定点 PEG 化）

▸ 固相合成含单一 Cys 残基的多肽（Cys 侧链用 Trt 保护）；

▸ 切割后脱除 Trt 保护基，得到含游离巯基的多肽；

▸ 加入 mPEG‑MAL（马来酰亚胺活化 PEG，分子量可选），在 pH 6.5‑7.5 的磷酸缓冲液中，25℃反应 2h（巯基与马来酰亚胺发生迈克尔加成反应）；

▸ 用制备型 HPLC 纯化，冻干得到 PEG 化多肽。

短肽 通常不具有免疫性， 必须和载体蛋白耦合才能产生抗体 。多聚抗原肽（MAP）由多个连接到赖氨酸核的相同多肽构成，能特异性表达高效免疫原，可用来制备肽‑载体蛋白耦联体。

图6. MAP2,MAP4,MAP8,MAP16对称或非对称多聚抗原肽合成

MAP多肽可以在MAP树脂上利用固相合成法分步合成。然而，不完整的耦合会在一些分支上产生遗失或截断肽链，因而表现不出原本MAP多肽的性质。作为替代性的方法，多肽可以单独制备和纯化然后再耦联到MAP上。连接到多肽核心上的多肽序列是明确的，并且很容易通过质谱表征。

异戊二烯化（Prenylation）是通过在靶蛋白的特定半胱氨酸残基上共价 添加异戊二烯基团 ，改变蛋白质的疏水性和亚细胞定位。蛋白质的异戊二烯化可以提高细胞膜亲和性，形成蛋白质‑蛋白质相互作用。

异戊二烯化的蛋白质包括 酪氨酸磷酸酶 、 小GTP酶 、 协同伴侣分子 、 核纤层和着丝粒结合蛋白 。异戊二烯化的多肽可以利用树脂上的异戊二烯化方法或者引入半胱氨酸衍生物制备。

多肽修饰是一种设计多肽的重要手段，经过化学修饰的多肽不仅可以维持较高的生物活性, 而且能够有效地避免免疫原性和毒性方面的缺点，同时化学修饰可以赋予多肽一些新的优良性能。随着科学技术的不断发展，新的多肽修饰方法也在不断涌现，未来将为多肽的研究和应用提供更多的可能性！强耀生物专注 多肽合成 、 蛋白表达 、 抗体制备 三大领域，致力于为客户提供更实在、更用心的生命科学科研服务解决方案。